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01.02.2016 | Hautalterung | Übersichtsartikel | Onlineartikel

Experimentelle Modelle humaner Hautalterung

aus: Der Hautarzt 2/2016

Zeitschrift:
Der Hautarzt

Autoren: G. Nikolakis, C. Zoschke, E. Makrantonaki, C. Hausmann, M. Schäfer-Korting, Prof. Dr. med. Prof. h.c. Dr. h.c. C. C. Zouboulis

Verlag: Springer Berlin Heidelberg

Abstrakt

Die Haut stellt ein repräsentatives Model für die Erforschung der humanen Alterung dar. Trotz hoher regenerativer Kapazität der Haut verändert sich die Hautphysiologie im Laufe des Lebens. Die medizinische als auch die kosmetische Forschung versuchen Alterungsprozessen vorzubeugen, diese zu verlangsamen, anzuhalten oder umzukehren. Auswirkungen der alternsassoziierten DNA-Schäden und strukturellen Hautveränderungen auf pharmakologische Parameter sind größtenteils unbekannt. Dieser Übersichtsartikel fasst den Stand der Wissenschaft im Bereich experimenteller Modelle humaner Hautalterung zusammen und zeigt Ansätze zur Verbesserung organotypischer Hautmodelle auf, um prädiktive Modelle der Hautalterung zu entwickeln und die Alterungsforschung zu verbessern.
Ob und, wenn ja, in welcher Weise Hautalterung die Wirkung von Dermatika, aber auch die von Umweltgiften beeinflusst, ist bislang wenig erforscht, gewinnt aber aufgrund des demografischen Wandels zunehmend an Bedeutung. Um die Einflüsse der Hautalterung auf die Arzneimittelwirkung bereits in der präklinischen Arzneimittelentwicklung berücksichtigen zu können, werden prädiktive Modelle benötigt. Dieser Übersichtsartikel beschreibt Möglichkeiten und Grenzen aktuell erforschter Erkrankungen sowie eingesetzter Tiermodelle, zweidimensionaler Zellkulturmodelle, Hautmodelle ex vivo und organotypischer Modelle der Hautalterung und ordnet ihre Bedeutung für die Alterungsforschung ein.

Humane Haut

Zur Hautalterung tragen intrinsische (genetisch, zellulär, hormonell) und extrinsische [primär Ultraviolett (UV)-Strahlung, sekundär onkogen, iatrogen, stressinduziert] Faktoren bei [ 46] (Abb.  1). Deren Auswirkungen auf die Haut werden in der Abb.  2 zusammengefasst.
Basierend auf diesen didaktisch relevanten Varianten der Hautalterung werden in der Regel 2 Körperlokalisationen als Referenzregionen für die Entnahme von Hautproben betrachtet. Das Modell der intrinsischen Hautalterung benötigt Haut, die aus nicht lichtexponierten Arealen stammt, nämlich aus der inneren Seite des Oberarms und ggf. aus der glutealen Region. Andererseits sind für die extrinsische Hautalterung Hautareale aus lichtexponierten Lokalisationen geeignet (z. B. Gesichtshaut, Nacken, Handrücken) [ 30].
Intrinsische Hautalterung manifestiert sich durch Hautatrophie mit feinen Falten und Abnahme des subkutanen Fettgewebes, prominenter Trockenheit und reduzierter Elastizität. Die extrinsisch gealterte Haut wird durch tiefe Falten, Verdickung der Epidermis, Rauigkeit, Teleangiektasien und Pigmentstörungen gekennzeichnet [ 4, 12, 19, 21, 24, 29]. Mikroskopisch sind eine Abflachung der dermoepidermalen Übergangszone sowie eine veränderte Zusammensetzung der extrazellulären Matrix und xerotische Haut allgemein anerkannte Charakteristika alter Haut [ 23, 40, 41]. Kollagenzusammensetzung und -struktur verschlechtern sich in extrinsisch gealterter Haut früher als in intrinsisch gealterter Haut [ 12]. Die großen individuellen Unterschiede in der Geschwindigkeit des Alterns erschweren klare Aussagen dazu. Sebumproduktion, transepidermaler Wasserverlust und epidermaler Turnover verändern sich ebenfalls durch Hautalterung und beeinflussen theoretisch die Hautbarriere [ 23, 38]. Die differenzielle Genexpression humaner Altershaut kann alterungsbedingte zelluläre Veränderungen des Fettsäuremetabolismus, der mitochondrialen Aktivität und die Entstehung von Tumoren erklären [ 15, 26]. Des Weiteren wurden einige differenziell exprimierte Gene detektiert, die mit der Alterung des zentralen Nervensystems zusammenhängen [ 26].

Progeroidsyndrome als Modelle zum besseren Verständnis der Hautalterung

Progeroidsyndrome sind Syndrome, die phänotypische Merkmale einer frühzeitigen Alterung aufweisen. Die Erforschung solcher Krankheitsbilder könnte zentrale pathophysiologische Mechanismen der Hautalterung entschlüsseln.
Das Hutchinson-Gilford-Syndrom ist eine seltene hereditäre Erkrankung mit klinischen Zeichen einer frühzeitigen Alterung (Progerie). Die Symptome der Erkrankung umfassen Sklerodermie-ähnliche Hautveränderungen, Alopezie, Fehlen des subkutanen Fettgewebes, Abnormalitäten der Knochen, Wachstumshemmung und Gelenksteifigkeit. Die durchschnittliche Lebenserwartung der Patienten beträgt 13 Jahre, und eine atherosklerotische Herzerkrankung ist in meisten Fällen die Todesursache [ 7, 28]. Im Zusammenhang mit dem Hutchinson-Gilford-Syndrom wurde Progerin, ein 50 Aminosäuren großes Protein, nachgewiesen [ 13, 27].
Die frühzeitige Erschöpfung der Stammzellen wurde als Erklärung des Progeriephänotyps postuliert.
Maus-Stammzellen mit progeroidem Phänotyp zeigen eine reduzierte klonogene Kapazität im Vergleich zur Kontrolle [ 34]. Weitere Syndrome, die sich mit einem frühzeitigen Hautalterungsphänotyp manifestieren, sind das Werner-Syndrom, das Bloom-Syndrom, das Cockayne-Syndrom, die Trichothiodystrophie, die Ataxia teleangiectatica (Louis-Bar-Syndrom), das Rothmund-Thomson-Syndrom und Xeroderma pigmentosum [ 5].

Tiermodelle

Das erste Tiermodell zur Replikation humaner intrinsischer Hautalterung ist die Klotho-Maus (kl /kl ). Bei verminderter Lebenserwartung (8 bis 9 Wochen) zeigt die Klotho-Maus neben einer Hautatrophie Infertilität, Arteriosklerose, Emphysem und Osteoporose. Das Klotho-Gen kodiert ein Membranprotein ähnlich den β-Galaktosidasen und ist an Signalwegen des Alterungsprozesses beteiligt. Da die nichttransgene, d. h. kl-positive Maus auch im hohen Alter diesen Phänotyp nicht aufweist, ähnelt dieses Tiermodell funktionell den humanen Progeroidsyndromen [ 20].
Die UV-Strahlung und deren Effekte dienen zur Induktion extrinsischer Hautalterung. Ihre chronischen Effekte werden entweder durch die mehrmalige Bestrahlung von Mäusen mit suberythemalen UV-Dosen oder durch langzeitige UV-Exposition nachgebildet. Die „Tsumura Suzuki obese diabetic mouse“ (fettleibige Diabetesmaus) weist 24 h nach UV-Exposition eine dünnere Epidermis und Dermis, dickere Fettschichten, veränderte Kollagenstruktur und eine erhöhte Konzentration des Entzündungsmarkers Tumornekrosefaktor-α als die Kontrollmaus auf [ 1].
Um die in vivo erhöhte Bildung Kollagen abbauender Matrixmetalloproteinase 1 (MMP1) im Tiermodell darzustellen, erfolgen Untersuchungen bei transgenen Mäusen mit einer sich selbst aktivierenden MMP1-Variante (K5-hMMP-1/V94GTg). Die Haut dieser Mäuse weist – im Alter von 7 Monaten – eine geringere Kollagendichte sowie weniger geordnete und stärker fragmentierte Kollagenfibrillen auf als die Haut von Kontrollmäusen. Die im Tiermodell induzierten Funktionsänderungen entsprechen dabei solchen, die in Biopsien aus dem Unterarm älterer Menschen nachgewiesen wurden. Darüber hinaus zeigten die Fibroblasten der transgenen Mäuse eine veränderte Morphologie [ 42]. Bei weiteren Nagetiermodellen (aMUPA-Maus, OLETF-Maus, HWY-Ratte) wurden Alterungseffekte auf die Hautbarriere nachgewiesen.
Die Prädiktivität von Tierversuchen für den Menschen überzeugt nicht vollständig
Trotz der Notwendigkeit von Tierversuchen zur präklinischen Entwicklung neuer Arzneistoffe und trotz der bislang mittels Tierversuchen erzielten Erfolge überzeugt die Prädiktivität von Tierversuchen für den Menschen nicht vollständig: 51 % von in Tierversuchen aussichtsreichen Arzneistoffkandidaten scheitern in der klinischen Prüfung aufgrund nicht überzeugender Wirkung beim Patienten und weitere 19 % aufgrund nicht vertretbarer unerwünschter Wirkungen [ 16]. Daher steht die Entwicklung humanzellbasierter Modelle im Fokus neuerer Forschung.

Einschichtzellkulturen der humanen Altershaut

Humane Fibroblasten und Keratinozyten sind einfach zu isolieren und zu kultivieren. Aus gealterter Humanhaut isoliert, werden sie zur Identifizierung von Biomarkern der humanen Hautalterung verwendet. Ein zuverlässiger Altersmarker ist die β-Galaktosidase-Aktivität bei pH 6 (Seneszenz-assoziierte β-Galaktosidase, SAβGal). Bei mehrfacher Passagierung (Subkultivierung) von Hautzellen und nach Induktion von glykierten Proteinen („advanced glycated endproducts“, AGEs) steigt die SAβGal-Aktivität [ 32]. Eine erhöhte Aktivität dieses Enzyms zeigt auch die humane Haut von Spendern im hohen Lebensalter im Vergleich zu Haut von jung-adulten Spendern [ 10]. Aus einer Vielzahl weiterer Altersmarker favorisieren wir aufgrund vergleichbarer In-vivo- und Ex-vivo-Ergebnisse folgende Marker: 53BP1/γH2AX foci, p16INK4A, oxidative DNA-Schäden zur Detektion genetischer Veränderungen im Nukleus sowie Progerin als Indikator für alternatives Splicing [ 39]. Genetische Veränderungen im Nukleus werden zusammenfassend als DNA-SCARS bezeichnet, wobei γH2AX foci die Schädigungen stabilisieren [ 33]. Fibroblasten – im Gegensatz zu Keratinozyten – eignen sich besonders gut für die Untersuchung zellulärer Alterungsprozesse, da Fibroblasten als postmitotische Zellen lange in unveränderter Form in der Haut verbleiben. Wie bei chronologisch gealterter humaner Haut unterscheiden sich in vitro kultivierte alte Fibroblasten von juvenilen Zellen durch die Anhäufung von DNA-Schäden, veränderte RNA-Prozessierung, epigenetische Veränderungen sowie ein verändertes Zytoskelett. Noch nicht hinreichend vergleichend geprüft sind dagegen Veränderungen der Proteostase, mitochondriale Schäden, die Kommunikation der Zellen mittels sezernierter Botenstoffe (zelluläres Cross-talk), die Adaptation gegenüber extrinsischen Stressfaktoren, die zirkadiane Regulation sowie genom- und proteomweite Veränderungen. Bei Telomerverkürzungen und Proteasomveränderungen liegen widersprüchliche Ergebnisse im Vergleich zu humaner Haut vor [ 25].
Fibroblasten eignen sich gut für die Untersuchung zellulärer Alterungsprozesse
Seneszenz wird als Verlust der Proliferationsfähigkeit bei erhaltener metabolischer Aktivität durch einen irreversiblen Zellzyklusarrest bezeichnet und von einigen Autoren als Ausweg der Zelle bei maligner Transformation betrachtet. DNA-Schäden triggern p53, pRB, p16 INK4A und p21-Signalwege und aktivieren SAβGal, sodass bestimmte Heterochromatinstrukturen akkumulieren und die Zytokinsekretion steigt [ 39]. Seneszenzbedingte Veränderungen der Zytokin- und Proteinsekretion werden als „senescence-associated secretory phenotype“ (SASP) bezeichnet, die die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine und Matrixmetalloproteinasen induzieren und Stammzellen beeinträchtigen [ 14]. Das Sekretom, d. h. die gesamten freigesetzten Proteine, bleibt jedoch noch unerforscht [ 39].
Intrinsische Alterung wird in Zellen durch mehrfache Passagierung (replikative Seneszenz; [ 10, 17]) oder durch längere Kulturdauer [ 10] induziert. Durch Supplementierung der Zellkulturmedien mit AGEs [ 32] werden Altersmarker detektiert.
Extrinsische Faktoren (subtoxische H 2O 2-Konzentrationen, UV-Bestrahlung) schädigen die Zellen durch Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Alterungseffekte, bedingt durch extrinsische Faktoren, unterscheiden sich in der Proteinexpression von replikativer Seneszenz und werden als stressinduzierte frühzeitige Seneszenz (SIPS) zusammengefasst [ 9].

Hormonelle Regulation der Alterung

Ein alternatives Modell zur intrinsischen Hautalterung ist die Behandlung einzelner Hautschichtkulturen mit altersspezifischen Hormonmischungen. Makrantonaki et al. [ 25] haben Fibroblasten und Talgdrüsenzellen mit einer hormonellen Mischung von 20-jährigen und 60-jährigen Frauen in vitro behandelt. Die Hormonbehandlung führte zu signifikanter Reduktion der Lipogenese unter den 60-jährigen Hormonbedingungen im Vergleich zur Behandlung mit dem hormonellen Gemisch der 20-jährigen Frauen. Darüber hinaus wurden Unterschiede der Genexpression beobachtet, die mit DNA-Reparatur, oxidativem Stress, Ubiquitin-induzierter Proteolyse, Zellzyklus und dem Tumorwachstumsfaktor-β (TGF-β)-Signalweg assoziiert sind [ 25]. Auch Gene wurde reguliert, die zur Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen beitragen [ 26].

Weitere zweidimensionale Modelle in vitro

Zellarten, die aus Adnexen stammen, wurden ebenfalls als zweidimensionale Modelle in vitro für die Erforschung der Hautalterung eingesetzt: Der Haarfollikel und insbesondere die Fibroblasten aus der dermalen Papilla (DPF) sind alterungsanfällig [ 6]. Die DPFs von Patienten mit androgenetischer Alopezie exprimierten stärker den Seneszenzmarker p16INK4a. Die Behandlung mit Androgenen führte zur Expression dieses Markers bei DPFs aus der transitionellen Zone alopezischer Herde des Kopfes, aber nicht aus Bartfollikeln [ 43]. Oxidativer Stress verursacht eine selektive Apoptose der melanozytären Stammzellen durch die Erschöpfung der B-cell lymphoma-2 (BCL-2)-Genexpression. Die BCL-2-Expression ermöglicht den Melanozyten, den UV-induzierten ROS-Schaden zu meiden [ 36].

Hautkulturmodell ex vivo

Die begrenzte Vitalität der kultivierten Haut ex vivo hat die Anwendung dieses am meisten den In-vivo-Bedingungen nahestehenden Modells stark reduziert. Allerdings kann die Kokultur von Haut ex vivo in direktem Kontakt mit kultivierten SZ95-Talgdrüsenzellen [ 47] die Vitalität der kultivierten Haut und insbesondere der Epidermis positiv beeinflussen [ 31]. Die Haut zeigt in diesem Modell insgesamt eine verbesserte strukturelle Integrität der Epidermis, einen höheren Prozentsatz von proliferierenden basalen Keratinozyten und eine Verringerung der Apoptose differenzierter Keratinozyten nach 6 Tagen. Auf der anderen Seite zeigen die kokultivierten Sebozyten morphologische und biochemische Charakteristika einer normalen Differenzierung und Lipidakkumulation [ 45], während die Sekretion von Entzündungsmolekülen im Überstand der Kokultur im Vergleich zur Sekretion allein kultivierter Haut normalisiert wird. Dieses Modell kann beim Einsatz entsprechender Hautpräparate universell, d. h. auch in der Erforschung der Hautalterung bzw. von Hautalterung-assoziierten Erkrankungen und Tumoren eingesetzt werden [ 31].

Rekonstruierte humane Altershaut

Dreidimensionale Hautmodelle können komplexe Fragestellungen bezüglich der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen adressieren und den Mangel an Bioptaten partiell ausgleichen. Rekonstruierte humane Epidermis (RHE) und rekonstruierte humane Vollhaut („reconstructed human skin“, RHS) weisen gewisse Ähnlichkeiten zur menschlichen Haut hinsichtlich der Stratum-corneum-Lipide, der Tight-junction-Barriere sowie des Hautoberflächen-pH-Werts auf. Die RHE entsteht bei der Kultur (primärer) humaner Keratinozyten auf einer Polymermembran bzw. Kollagenschicht an der Luft-Medium-Grenze.
Intrinsische Hautalterung wird in Organoiden derzeit durch Verwendung chronologisch oder vorzeitig gealterter Fibroblasten oder durch Glykierung der extrazellulären Matrix nachgestellt. Die wiederholte Passagierung von Fibroblasten und deren Verwendung in RHS führt zu einem dünneren dermalen Kompartiment, erhöhter MMP1-Sekretion, erhöhter Keratin-6- sowie verminderter Keratin-10-Expression. Einige altersspezifische Marker, wie z. B. SAβGal, eigneten sich zur Charakterisierung von RHS aufgrund unspezifischer Akkumulation nicht [ 18]. Bei Verlängerung der üblichen RHS-Kulturdauer von ca. 20 auf 120 Tage nehmen die epidermale Dicke und die Anzahl der proliferierenden, Ki-67-positiven Keratinozyten ab. Sowohl epidermale Differenzierung (Loricrin, Filaggrin, Involucrin, Transglutaminase) als auch epidermale Verankerung (doppelte Lamina densa, veränderte Hemidesmosomen) sind alterstypisch verändert. Hyaluronan und CD44 sind reduziert, und der im Alter erhöhte Zellzyklusmarker p16 INK4A steigt signifikant [ 11]. Um die Eigenschaften des Modells zu verbessern, wurde die konventionelle Kollagenmatrix durch ein poröses Kollagen-Glycosaminoglycan-Chitosan-Polymer ausgetauscht. Die altersassoziierte Glykierung der extrazellulären Matrix wird durch kontinuierliche Glyoxalzufuhr induziert. Die Supplementierung des Kulturmediums mit Glyoxal erhöht die Anzahl an N-Carboxymethyllysinmolekülen (ein AGE-Vertreter) in der RHS, die Keratinozytendifferenzierung sinkt. Der Glykierungshemmer Aminoguanidin unterdrückt die Glyoxaleffekte vollständig [ 3]. Trotzdem sind RHS-Langzeitkulturen aufgrund fehlender epidermaler Stammzellen und fehlender epidermaler Desquamation noch kein allgemein akzeptiertes Standardverfahren.
Extrinsische Hautalterung wird in Organoiden durch Behandlung mit Mitomycin C erzielt, das den Zellzyklus arretiert. Eine RHS, gebildet aus Mitomycin-C-behandelten Fibroblasten und juvenilen Keratinozyten, zeigte einige der typischen Veränderungen gealterter Haut wie verringerte Filaggrinexpression, verringerte Elastin- und Kollagenproduktion, erhöhte MMP1-Aktivität sowie veränderte Fibroblastenmorphologie [ 8]. Suberythemale UVB-Bestrahlung erhöhte die SAbGal-Aktivität in primären juvenilen Keratinozyten, sodass RHE aus diesen Zellen mehr proinflammatorische Zytokine (IL-1a/IL-8) freisetzt und eine verminderte epidermale Differenzierung (Morphologie, Filaggrin, Involucrin) aufweist [ 22]. 
Eine langfristige UV-Exposition führt zu malignen Veränderungen der Keratinozyten wie z. B. beim Plattenepithelkarzinom.
Da das durchschnittliche Erkrankungsalter in Deutschland 70 Jahre beträgt, müssen zur Rekonstruktion der Erkrankung die UV-Effekte nach jahrzehntelanger Exposition nachgebildet werden. Derzeit erfolgt dies mittels Kokultur von Karzinomzelllinien (Abb.  3). Krankheitsmodelle der Haut dienen sowohl dem besseren Verständnis der Erkrankung als auch der Testung neuer Arzneistoffkandidaten auf lokale Wirksamkeit und Sicherheit [ 2]. Voraussetzung für die erfolgreiche Integration von Organoiden in die präklinische Arzneimittelentwicklung ist die detaillierte Charakterisierung der Modelle sowie deren Validierung anhand bereits bekannter, zugelassener Arzneimittel [ 44]. Unter der Voraussetzung, ein prädiktives Modell entwickelt zu haben, können zunächst die lokale Wirksamkeit und Sicherheit des Arzneistoffkandidaten mittels des dreidimensionalen Modells bewertet werden [ 44].

Fazit für die Praxis

  • Es gibt kein Modell, das alle Aspekte humaner Hautalterung abbildet, aber diverse experimentelle Ansätze, die jeweils wesentliche Teilaspekte humaner Hautalterung darstellen.
  • Obwohl Tierversuche zur Beurteilung systemischer Arzneimittelwirkungen nötig sind, ist deren Prädiktivität in der präklinischen Arzneimittelentwicklung begrenzt [ 16]. Die Entwicklung komplexer Kultursysteme ist Gegenstand aktueller Forschung.
  • Die Entwicklung, Validierung und Integration humanzellbasierter Ansätze in die präklinische Forschung können die Bewertung von Arzneistoffkandidaten und neuen Formulierungen verbessern sowie die Zahl der Tierversuche reduzieren.

Einhaltung ethischer Richtlinien

Interessenkonflikt

G. Nikolakis, C. Zoschke, E. Makrantonaki, C. Hausmann, M. Schäfer-Korting und C.C. Zouboulis bestätigen, dass kein Interessenkonflikt besteht. M. Schäfer-Korting ist Teilprojektleiterin und C. Hausmann Doktorand (Promotionsstipendium) des durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft geförderten Sonderforschungsbereiches 1112. C.C. Zouboulis ist Träger des Felix-Wankel-Tierschutz-Forschungspreises der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München (2000). Das Modell der kokultivierten Haut ex vivo zum direkten Kontakt mit SZ95-Talgdrüsenzellen wird durch das internationale Patent WO0046353 geschützt.
Dieser Beitrag beinhaltet keine Studien an Menschen oder Tieren.
Literatur